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客户文章 | 12分+,ChIP-seq助力多发性骨髓瘤骨髓血管生成关键因子的发现

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发表单位:华中科技大学同济医学院协和医院血液学研究所

发表时间:2021年9月6日

发表期刊:LeukemiaIF:12.883


2021年9月6日,华中科技大学同济医学院协和医院血液学研究所在期刊LeukemiaIF:12.883)发表题为“JunB is a key regulator of multiple myeloma bone marrow angiogenesis”的研究论文。爱基百客为该技术提供ChIP-seq的技术支持。

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一、背景介绍

多发性骨髓瘤(MM)是第二常见的血液系统恶性肿瘤,其特征是骨髓(BM)内恶性浆细胞的过度克隆增殖、肾脏疾病、免疫缺陷和溶骨性骨病变。已在MM患者的BM微环境中报道了增强的微血管密度(MVD)、内皮活性、毛细血管通透性和灌注。BM血管生成的增加与疾病从未知意义的单克隆γ病(MGUS)向MM的转变平行,与MM进展和不良预后相关,并随着抗MM治疗的成功而减少。BM内MVD的增加是由癌基因介导的细胞因子和促血管生成生长因子(如VEGF、IGF1、bFGF、VEGFB、HGF、CTGF、TGFA、IL15和ADM)的表达和分泌触发的。显著的临床反应使沙利度胺成为第一个进入肿瘤治疗的抗血管生成药物,并预示着革新MM治疗策略的新型药物时代的到来。尽管如此,MM仍然是一种不治之症。因此需要新靶点的鉴定和衍生的有效抗MM剂的开发。


激活蛋白1(AP-1)转录因子(TF)家族成员JunB通过建立适当的胎母循环系统对哺乳动物胎盘形成至关重要。此外,临床前研究表明JunB作为血管生成因子(AF)的关键激活剂,尤其是VEGF,在乳腺癌、肾细胞癌和畸胎癌中的关键作用。然而,目前尚未研究JunB活性对BM血管生成(MM发病机制的标志)的影响。


基于此,作者首次展示了JunB在MM/BM血管生成中的作用,并揭示了该TF在MM发病机制中的病理生理功能的新方面。因此,这些数据强烈支持正在进行的开发用于MM治疗的JunB靶向药物的努力,以针对疾病的多个方面并进一步提高患者的预后。


二、研究思路

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三、研究材料

3.1试剂

重组人白细胞介素 6(IL6)——诱导JunB表达上调

MEK1/2和NFkB抑制剂

4-OHT——诱导JunB-ER/MM.1S细胞中JunB融合蛋白表达

多西环素——抗炎剂,诱导JunB表达降低


3.2 人MM细胞系

三组生物学重复:用于JunB融合蛋白表达、敲低等,进行细胞功能分析,小鼠体内研究肿瘤血管生成。

二组生物学重复:用于ChIP-seq实验。


3.3 MM患者临床骨髓活检样本(10名)

用于CD31、JunB的免疫组化染色分析和血管检测。


四、研究结果

4.1 JunB表达与MM细胞中血管生成因子的表达谱相关

为了研究JunB是否影响MM细胞产生和分泌AF,从而影响BM血管生成,作者首先使用公开可用的数据集GSE5900和GSE2658对健康供体与MGUS和MM样本中的JunB和AF进行了比较监督分析,结果发现从健康供体到MGUS和MM,AFs中VEGF、VEGFB、IGF1、PIGF、HGF、CTGF、TGFB1、IL6和IL15的mRNA水平以及JunB mRNA水平逐渐增加。随后,为了确定这些转录因子在BM微环境中的独立和潜在冗余血管生成作用,对JunB和Hif-1α与AF之间的相关性评分进行了分析。分析结果表示JunB对MM细胞中AFs的VEGF、VEGFB和IGF1存在调节作用,并支持存在两个独立的JunB和Hif-1α介导的血管生成转录程序。这些数据表明JunB与不同AF的相关表达可能与肿瘤细胞的分子背景有关。

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图1 JunB的表达与MM细胞系和原代细胞中血管生成因子的表达谱相关


4.2 IL6而不是缺氧,诱导了血管生成因子的JunB依赖性产生和分泌

由于发现JunB和Hif-1α诱导不同的转录程序,作者接下来研究了缺氧对BM微环境中JunB与Hif-1α蛋白水平的功能影响。结果表明,在常氧或缺氧条件下,Hif-1α敲低不会改变IL6诱导的JunB上调。相反,即使在JunB敲低后,缺氧也会增加Hif-1α水平。之前的研究结果表明,MM细胞中的JunB上调主要通过BMSC分泌的细胞因子介导,尤其是IL6。作者接下来研究了JunB是否使用多西环素诱导的shRNA策略调节MM-BM微环境中AF的表达。结果发现四环素和多西环素能够有效降低IL6诱导的JunB的表达,部分AFs如VEGF、VEGFB和IGF1的分泌也被降低。


总之,这些结果表明JunB和Hif-1α表达水平分别受BM微环境、细胞室和液体环境以及缺氧内的不同特征的功能调节。并且JunB能够介导AFsVEGF、VEGFB和IGF1的产生和分泌。


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图2 IL6而不是缺氧诱导了junb依赖性的血管生成因子的产生和分泌


4.3 JunB以MEK/MAPK和NFkB依赖性但不依赖Ras的方式增加血管生成因子的产生和分泌

为了进一步支持JunB在MM-BM血管生成时AF生成和分泌中的功能作用,作者构建了JunB-ER/MM.1S细胞,这类细胞能够被4-OHT诱导进而组成性表达由JunB与激素融合组成的嵌合蛋白-ER的结合域。RT-qPCR结果表明,JunB诱导表达的细胞系中VEGF、VEGFB和IGF1的表达上调。此前研究表明,IL6触发的JunB上调是MEK/MAPK和NFκB依赖性的,但不依赖PI3K/Akt。在进行MEK抑制剂和NFkB抑制剂处理后,IL6诱导的MM细胞中VEGF、VEGFB和IGF1的表达下调,随后4-OHT诱导的JunB激活表达能够重新上调这些AFs的表达,进一步证实了JunB在AFs产生中的关键作用。


由于高达50%的MM患者存在K-或N-Ras致癌基因的激活突变,作者接下来研究了JunB是否是Ras突变的MM患者的可操作靶标。但结果发现Ras野生型和突变细胞中的JunB表达水平类似,并且siJunB诱导带来的VEGF、VEGFB和IGF1的抑制也并不受Ras突变影响。


总之,这些结果表明JunB活性对AF产生的影响是MEK/ERK和NF-κB依赖性的,但与Ras状态无关。


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表3 MM细胞中4-OHT诱导的JunB活性增加血管生成因子的产生和分泌


4.4 VEGF和IGF1是MM细胞中JunB的直接转录靶点

为了找到JunB的直接作用靶基因,作者对IL6刺激的MM.1S细胞进行了ChIP-seq分析,并利用STRING进行了蛋白质-蛋白质相互作用富集分析。结果使用PROMO以及JASPAR数据库进行了motif预测鉴定。最后确定VEGF和IGF1是JunB的直接靶标。因此,ChIP-seq数据揭示了JunB在MM细胞中调节靶基因的机制,并进一步支持JunB在MM血管生成中的功能作用。

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图4 VEGF和IGF1是JunB在MM细胞中的直接转录靶点


4.5 MM细胞中的JunB敲低导致体外和体内血管生成的抑制

血管生成是一个复杂的多步骤过程,需要内皮细胞(EC)的协调活动。细胞因子和生长因子的血管生成作用的一个指标是它们能够刺激EC迁移从而能够促进小管形成。为此,作者接下来研究了JunB调节的AF的表达和分泌是否对BM血管生成有影响。作者对JunB敲低的MM细胞进行了伤口愈合分析、基质胶测定、小鼠移植实验(通过肿瘤切片检测血管生成),发现MM细胞的迁移及小鼠肿瘤血管生成明显减少,而JunB的重新激活(IL6诱导)能够刺激细胞迁移和血管生成。这些数据强烈支持JunB介导的AF生成和分泌有助于MMBM血管生成。随后作者利用抗JunB和CD31抗体对肿瘤切片进行了免疫荧光成像,发现JunB敲低显著减少了荧光染色结果,表明肿瘤生长的抑制至少部分是通过抗血管生成介导的。


基于以上结果,作者构建了JunB的调控网络。

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图5 JunB基因在MM细胞中的表达下调可抑制体内外血管生成



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图6 JunB在MM细胞中的阳性表达与创新的3D MM模型和患者来源的骨髓活检中的血管密度相关


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图7 JunB调节血管生成因子的表达和分泌,从而在MM中调节BM的血管生成


五、研究结论

本报告首次揭示了JunB不仅是MM细胞存活、增殖和耐药性的介质,而且还是AF的启动子MMBM血管生成的转录。结果强调了将AP-1转录因子(如JunB)作为MM治疗的一种有前景的策略的努力。


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文献下载

JunB is a key regulator of multiple myeloma bone marrow angiogenesis.pdf






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