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武汉爱基百客生物科技有限公司(简称爱基百客),注册于2014年12月31日,次年10月正式开始对外运营,是一家专业提供表观组学技术服务、高通量测序、单细胞测序分析的新型生物科技服务企业。

公司总员工已达到百余人,其中95%以上具有学士学位,40%以上具有硕士及以上学位,专职科研人员20余人,专职销售人员30余人,覆盖全国90%的省市,核心成员来自国内知名高效、基因测序公司、信息分析公司等。

公司运营至今销售额累积1亿左右,成为国内成长最迅速的二代测序与生物科研服务企业之一。




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干货!如何构建一个高质量的Hi-C文库 | Hi-C专题

Hi-C是目前最火的三维基因组学技术,它将3C技术和高通量测序技术结合,通过全点对全点的检测来描述真核基因组中染色质全基因组的相互作用。联合其他多组学数据,它还可以用于研究各种生物学问题,如核组织、基因转录调控、时空发育,辅助基因组装和癌症基因组学等。在过去的十年,Hi-C 的发展和应用极大改变了人们对基因组结构、染色质构象和基因相互作用的看法。鉴于此,Hi-C的需求越来越大,项目越来越多。本期小编系统介绍一下Hi-C的建库流程。

图片1.png

Hi-C建库流程


1、 甲醛交联


甲醛交联的目的主要是利用甲醛对细胞进行固定,使得DNA与蛋白质、蛋白质和蛋白质之间相互交联,维持细胞核的空间结构。关于甲醛交联,动物和植物有一定的区别。动物相对来说要简单一些,植物有细胞壁,导致甲醛不容易进入植物体内,需要将植物切碎,在真空条件下进行交联,甲醛浓度及交联时间需根据不同的样本进行摸索。


2、 细胞裂解


甲醛交联完后,需要进行细胞裂解收集细胞核。动植物裂解方法不同,一般动物使用NP40进行裂解,植物细胞使用TritonX-100来裂解。有条件的同学可以在裂解完之后,在显微镜下观察一下细胞核,确定是否充分裂解。裂解完之后离心去上清,收集细胞核。


3、 酶切


利用限制性内切酶对DNA进行酶切,使DNA两侧形成粘性末端,在这一步我们需摸索酶切条件,不同的样本酶切时间及用的酶的量有些区别,像有些难切的样本如肌肉等组织,延长酶切时间,保证酶切充分。


4、 末端补平,标记生物素


酶切完之后会形成一个粘性末端,这一步我们需要加入dATP、dGTP、dTTP和生物素C,将粘性末端补为平末端,同时标记上生物素C,便于后面用生物素磁珠进行捕获。


5、 连接


利用DNA连接酶,通过平末端连接生成嵌合分子。


6、 解交联


利用蛋白酶消化,解除DNA与蛋白的交联状态,并将DNA纯化。


7、 二代建库


将纯化后的DNA打断到300-500bp左右,使用生物素捕获磁珠捕获筛选出被生物素标记的DNA片段,通过二代建库获得DNA文库。


8、 测序


将建好的文库进行二代测序。

以上便是Hi-C建库的一个完整流程。


Hi-C建库质控


Hi-C建库的周期较长,要求较高,因此在实验这一块有几个质控点


首先是甲醛交联质控,这一步的目的:1、是检测甲醛交联的效果,如果交联效果良好,则提取DNA跑胶图看不到DNA条带(图一泳道1),解交联的样品可以看到明显的DNA条带(图一泳道2),2、检测样本DNA的完整性,要求样本DNA完整无降解(图一,泳道2)

图片2.png

然后是酶切连接质控,以四碱基酶Mbo1为例,理论上它的平均酶切片段为200多bp,酶切完之后条带为弥散型,没有DNA主带(图二泳道1),酶切完后末端补平,连接,提取DNA跑胶图,连接片段相对于酶切片段有明显的上移(图二泳道2)。严格的按照实验流程并做好每一步质控,就可以建好一个合格的Hi-C文库,当然除了个别难做的样本外。

图片3.png

爱基百客在Hi-C建库上有丰富的经验,目前已测试样本有多个。


动物:鼠心、鼠肝、鼠脾、鼠肾、鼠肌肉、等;


植物:青稞、水稻、泡桐、月季等。


以下是我们的部分样本的测试数据,比对率基本上可以达到90%以上,有效数据率达到70%以上。


物种

样品类型

测序平台

比对率

有效数据率

鼠心

动物

illumina

91%

90%

鼠肾

动物

illumina

92%

88%

肌肉

动物

illumina

92.90%

87%

水稻

植物

illumina

93%

76.60%


最后和大家提一下我们Hi-C的送样要求,植物要求寄送活体样本,老师们也可以自己交联好后,用干冰寄送;动物样本最好是新鲜取下来马上交联。另外取样量要求在0.5-1g左右,能够至少提取5-10ug左右的DNA。


爱基百客能够为各位老师提供Hi-C的测序和分析服务,另外我们有丰富的表观组学经验,利于有多组学分析需求的项目,欢迎有相关需求的老师前来咨询!


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